Enfermedades causadas por alteraciones en el "imprinting"

Las enfermedades humanas y síndromes relacionados con alteraciones en loci sujetos a impronta incluyen:
  • Síndrome de Prader Willi
  • Síndrome de Angelman
  • Síndrome de Beckwith-Wiedemann
  • Síndrome de Silver-Russell
  • Diabetes neonatal transitoria
  • Defectos sociocognitivos del Síndrome de Turner
  • Enfermedad trofoblástica gestacional
  • Teratomas
  • Neoplasias asociadas con pérdida de la impronta en loci oncogénicos

Tales enfermedades se clasifican de acuerdo a la región afectada del cromosoma correspondiente:
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L‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍as alteraciones en el "imprinting" de la región "q11-q13" del cromosoma 15 dependiente de su origen paterno o materno, dan lugar a los síndromes de Prader-Willi y Angelman respectivamente, que se describen a continuacion.

Síndrome de Prader-Willi (SPW)
Definición
Es un conjunto de signos y síntomas asociados a una alteración genética que se debe a una pérdida de genes (por distintos mecanismos) de una región crítica en el brazo largo del cromosoma 15, normalmente aportado por el padre (paternal).
Tal alteracion genética es congénita y afecta al sistema nervioso central provocando una disfunción del hipotálamo, cuya funcion nerviosa se relacion con el sueño y con sensaciones como la sed y el hambre. Además coordina las funciones hormonales que son causa de un metabolismo vital discrepante. El individuo que padece tal síndrome tiene adicción por comer, y no tiene, bioquimicamente, la sensacion de saciedad.

Aspectos Genéticos del Síndrome de Prader-Willi
Los distintos mecanismos genéticos que producen el SPW, resultan en la ausencia física o funcional de genes que se expresan sólo a partir del cromosoma 15 paterno, y que no pueden ser complementados al encontrarse estos mismos genes silenciados en el cromosoma 15 materno.
  1. Aproximadamente el 70% de los casos, se debe a una delección de un fragmento de ADN de 4 Mb de la región “q11-q13” en el cromosoma 15 procedente del padre. Ocurre de novo en la línea germinal masculina y no tiene origen hereditario.
  2. Aproximadamente el 25% de los casos, presenta disomia unimaternal, es decir, dos cromosomas 15 de origen materno y la falta del cromosoma 15 de origen paterno. Este hecho sucede por error en el reparto de cromosomas durante la división celular, y puede ser debida a varios mecanismos: Aproximadamente el 5% de los casos, es consecuencia de la herencia de un cromosoma 15 paterno con impronta materna, es decir, existe un patrón de metilación alterado que podría corresponderse a la existencia de una mutación en el centro del ‘imprinting’ o centro de “marcaje”, que regula la desmetilación (activación de genes) de la región “q11-q13” en el cromosoma 15 de origen paterno, provocando que los genes sean inactivados (silenciamiento). Ejemplo clásico, un error en el imprinting haría que un hombre transmitiera sus cromosomas con un Imprinting materno.
    • Corrección de una trisomía 15: Un oocito femenino con dos cromosomas 15 fecundado por un espermatozoide normal que produce un zigoto con trisomía 15, corregida por una no-disyunción mitótica (mecanismo que indica una falla en el proceso de distribución equitativa de dos cromosomas o cromátides, ocaciona que ambos se dirijan juntos y el otro polo no reciba nada). Por lo tanto pueden pasar 3 eventos: si se produce la pérdida del cromosoma 15 de origen paterno, en un tercio de los casos, se manifestará la patología, mientras que en los otros dos tercios resultará un embrión normal.Este mecanismo fue confirmado por Purvis Smith y colaboradores en 1992.
    • Corrección de una monosomía 15: Un error de no-disyunción meiótica en la línea germinal masculina produciría un espermatozoide nulisómico (sin cromosoma 15), que fecundado por un oocito normal produce un zigoto monosómico con sólo el cromosoma 15 materno. Este zigoto es no viable, pero la duplicación mitótica del cromosoma 15 materno causaría la disomía uniparental materna, dando lugar al síndrome.
    • Complementación gamética: Se produciría por la no-disyunción simultánea del cromosoma 15 en ambos progenitores, con la fecundación de un oocito disómico por parte de un espermatozoide nulisómico, formándose un zigoto con dos cromosomas 15 maternos, dando lugar a la enfermedad. Es el mecanismo más infrecuente. Descrita por primera vez por Park y colaboradores en 1998.
  3. No se conocen pacientes con SPW con solo una mutación, sugiriendo que este síndrome es una enfermedad de genes continuos.
  4. Además de las alteraciones genéticas anteriormente citadas, se han descripto casos aislados de translocaciones balanceadas paternas y monosomías regulares 15q11-13. Independientemente del mecanismo genético, nos encontramos ante una entidad en la que el fenotipo clínico dependería de la falta o de la ‘inactivación’ del material genético de la región 15q11-q13 de origen paterno.

Figura_2_-_Alteraciones_del_cromosoma_15_que_pueden_causar_SPW.png
Figura 1 - Alteraciones del cromosoma 15 que pueden causar SPW.

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Figura 2 - Esquema representativo de una de las cromátides del cromosoma 15.
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Figura 8 - Esquema de la región 15q11-q13. Genes de expresión bialélica, en bordo; genes de expresión materna, en azul; genes de expresión paterna, en morado. Las flechas indican la orientación de la trascripción. CI: centro regulador de la impronta.

El SPW no se hereda, ocurre al azar y no hay una causa bien esclarecida. El riesgo de que el SPW aparezca en la misma familia más de una vez, sucede solamente en raros casos (2 – 5%). Todos los niños cuyos SPW es sospechoso deberían tener un estudio genético, si el diagnostico se confirma, es recomendable que la familia reciba consejo de un genetista.

Historia
El síndrome fue descripto inicialmente por John Langdon Haydon Down en 1887 en una paciente a la cual diagnosticó de "polisarcia" o universalmente conocido como "obesidad". Posteriormente 3 doctores Suizos Andrea Prader, Alexis Labhart y Heinrich Willi del Hospital Infantil de la Universidad de Zurich en 1956 fueron los primeros en describir las características clínicas del síndrome estudiando un grupo pequeño de niños con obesidad, estatura baja, testículos no descendidos y deterioro mental con historia de hipotonía (bajo tono muscular) en el período neonatal dándole el nombre al síndrome.
En 1976, Hawkey y Smithies describieron el fallo genético en un paciente con síndrome de Prader Willi al que descubrieron anomalías en el cromosoma 15, siendo ésta una de las causas del síndrome de Prader-Willi.
En 1980 Ledbetter descubrió la existencia de una microdeleccion de la región 15q11-q13 y tres años más tarde Butler y Nicholls (1983) observan el fenómeno de impronta genómica en los pacientes con SPW. Por último, en 1993 Holm, tras un estudio multicéntrico, publicó los criterios vigentes para su diagnóstico.

Evidencias Clínicas
Clínicamente la alteración genética se expresa como un síndrome dismórfico que afecta fundamentalmente al sistema nervioso central con particular predilección por el hipotálamo. Básicamente se caracteriza por hipotonía muscular y problemas en la alimentación de su primera etapa, con desarrollo mental bajo, hiperfagia con obesidad extrema (si no se controla) a partir de los 2 años, baja estatura, hipogonadismo y discretos signos dismórficos.
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Figura 4 - Fenotipo del SPW en un niño de 9 meses.

Otras características frecuentes en los pacientes de SPW que pueden objetivarse en el niño pequeño son los rasgos faciales (ojos almendrados, boca triangular “de carpa”, diámetro bitemporal estrecho, estrabismo), las manos y pies pequeños en comparación con la talla, con dedos en forma de cono y borde cubital de la mano recto, la hipopigmentación de piel y cabello, y la consistencia espesa o viscosa de la saliva (que puede ocasionar grietas en las comisuras bucales e influir negativamente sobre la articulación del lenguaje y sobre la mayor incidencia de caries que afectará incluso a la dentición de leche).
Figura_4_-_Manos_pequeñas_con_dedos_en_forma_de_cono_y_borde_cubital_recto.png
Figura 4 - Manos pequeñas con dedos en forma de cono y borde cubital recto.

El comportamiento característico incluye (en respuesta a pequeñas frustraciones) arranques violentos, testarudez, carácter obsesivo y posesivo. Pueden mentir y robar fácilmente si hay comida a su alcance. Y es llamativa su manía por rascarse heridas o picaduras, incluso autolesionándose la piel con sus arañazos.
Por último, el retraso mental es la norma, generalmente ligero, a veces moderado y casi nunca severo. Como promedio su cociente intelectual es de 70. Por ello tienen dificultad para pensamientos y conceptos abstractos y tienen problemas de aprendizaje que hacen que, aunque a menudo puedan acudir a colegios normales, requieran educación especial a partir de la enseñanza secundaria.

Epidemiologia
El SPW tiene una incidencia estimada en 1/10.000 a 1/15.000 nacidos vivos, afecta a ambos sexos por igual, en todas las razas y condiciones de vida. La prevalencia de población es de 1:54.000 y 1:76.000 habitantes.

Diagnóstico
En 2001, Gunay-Aygun y colaboradores propusieron una serie de modificaciones sobre los criterios diagnósticos elaborados por Holm orientadas a efectuar una correcta derivación de los pacientes hacia un diagnóstico genético que permita determinar la existencia del síndrome con exactitud.
Diagnostico_Clinico.png
Las últimas recomendaciones para un correcto diagnóstico genético del síndrome de Prader Willi consisten en establecer:
  • Un cariotipo para reconocer las reorganizaciones cromosómicas de cromosomas metafásicos (empleando el antimitotico colcemid) con banda G para detectar posibles alteraciones de los mismos.
    chromosomesweb.jpg
    Cariotipos Normales. Imagen Izquierda: Prediseñada y coloreada. Imagen derecha: Real, bajo microscopía electrónica.
  • Realizar de forma sistemática, a todos los recién nacidos que presenten hipotonía severa, el test de metilación como prueba inicial del cribado. Existen 2 pruebas:
    • Test de metilación mediante Southern blot: la región 15q11-q13 previamente digerida con las enzimas de restricción Hind III y Hpa II (sensibles al estado de metilacion, es decir, no cortan en el sitio especifico si el mismo se encuentra metilado) y posterior hibridacion con la sonda PW71B.
Metilacion_Southern_Blot.png
Línea 1: ADN control. Línea 2: paciente con Síndrome de Angelman. Líneas 3: Individuo normal. Línea 4: paciente con Síndrome de Prader-Willi. Las bandas de 6 y 4 Kb corresponden a los patrones normales de hibridación obtenidos en un individuo control que no tiene metilada la región15q13. Cuando existe metilación de la región donde se localiza el gen responsable del S.Prader Willi o del S.de Angelman, la enzima HpaII que es sensible al estado de metilación, no digiere el ADN observándose únicamente una sola banda de 4Kb (línea 2) o de 6Kb (línea 6), según sea el diagnóstico de Angelman o de Prader Willi
    • Test de metilación mediante PCR: la región 15q11-q13, previamente se desnaturalizó en una disolución de hidróxido de sodio, e incubado a 55ºC durante 16 horas en oscuridad con hidroquinona y bisulfito sódico. Posteriormente a este tratamiento, el ADN modificado se purificó y se realizo la Reaccion en Cadena de la Polimerasa utilizando cebadores y condiciones de reacción estrictamente controladas. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa Metaphor (FMC) al 3%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta.
Metilacion_PCR.png
Línea 1: ADN control. Líneas 2: paciente con síndrome de Angelman. Línea 3: individuo normal. Línea 4: paciente con síndrome de Prader-Willi. El ADN que fue tratado con bisulfito siguiendo el protocolo de secuenciación genómica, se consiguió convertir las citosinas en uracilos, excepto aquéllas que se encuentran metiladas las cuales permanecerán inalteradas. De este modo, variará la secuencia nucleotídica, pudiéndose diferenciar el ADN que se encuentra metilado del que no lo está. Esta diferencia en la secuencia permite realizar amplificaciones específicas para cada alelo. Los individuos normales presentan las 2 bandas amplificadas (materna y paterna), los pacientes con SPW solo muestran la banda materna (174pb), y los pacientes con SA sólo la paterna (100pb).
  • Si se obtiene un resultado de test de metilación positivo, debe realizarse una prueba de FISH (técnica de hibridación in situ), para ver si el fallo se debe a una delección. Para valorar la presencia o ausencia de delección en 15q11-q13 se han utilizado sondas comercializadas D15S11 y SNRPN dentro de la región crítica del SPW.
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Localización de las sondas en el cromosoma 15: La sonda D15S11 es de marcaje indirecto con digoxigenina y presenta una sonda control en la región distal 15q22 (PML). La sonda SNRPN es de marcaje directo. Además se incluyen dos sondas control, una centromérica para 15p11.2 (D15Z1) y otra distal para 15q22 (PML), que permite observar si ha habido alguna reorganización, como una translocación, que afecte a estas regiones.
Tras realizar la hibridación se observan al microscopio de fluorescencia las preparaciones y se cuentan unas 50 metafases para determinar si está o no presente la deleción. La forma de interpretar las señales observadas al microscopio es la siguiente:
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FISH.png
Imagen real de microscopía de fluorescencia. La fecha indica la deleción 15q11-q13 observada con la sonda SNRPN.
  • Si en el test anterior no se detecta la presencia de una delección, entonces se debe realizar un análisis de microsatélites que permita diferenciar si ambos cromosomas provienen del mismo origen parental (disomía uniparental materna), o si su origen es biparental (fallo del imprinting). Se han empleado siete microsatélites de la región 15q11-q13 correspondientes a los loci D15S11, D15S128, D15Z1 Y SNRPN de centrómero a telómero. Estos marcadores son repeticiones de CA y GT. Han sido escogidos por su informatividad y posición dentro de la región crítica de SPW.
    Un parámetro útil para esta selección es la heterocigosidad, que hace referencia a la proporción de heterocigotos en la población. Por ultimo se interpretan los resultados segun la siguiente tabla:
Interpretación_de_los_microsatélites.png
Interpretación de los microsatélites

Luego de obtener los resultados de cada tecnica experimentada se observa el algoritmo diagnóstico deductivo de esta patología:
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Tratamiento
El abordaje terapéutico del síndrome de Prader-Willi debe realizarse de forma multidisciplinar, ya que en el mismo deben participar distintos especialistas como endocrinólogos, neurólogos, psiquiatras, psicólogos, nutricionistas y cirujanos bariátricos como eje principal para el tratamiento de este complejo síndrome. Es decir, dadas las numerosas enfermedades que se producen simultáneamente, su tratamiento debe abordarse de forma individualizada dependiendo de la patología a tratar.
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Síndrome de Angelman (SA)
Definición
Es un conjunto de signos y síntomas asociados a una alteración genética que se debe a una pérdida de genes (por distintos mecanismos) de una región crítica en el brazo largo del cromosoma 15, normalmente aportado por la madre (maternal).
Tal alteracion genética es congénita (aunque los síntomas aparezcan entre los 3 a 7 años de edad) y produce desordenes neurológicos, cuya funcion nerviosa se relacion con braquicefalia con el occipucio plano, boca grande, lengua prominente, dientes separados, microcefalia y manos y pies pequeños. En el ámbito neurológico se contempla: grave retraso intelectual y motor, epilepsia, ataxia, trastornos del sueño y ausencia del habla. El patrón de conducta se caracteriza por ataques de risa sin motivo aparente, apariencia feliz, fascinación por el agua, personalidad fácilmente excitable e hiperactividad.

Aspectos Genéticos del Síndrome de Angelman
Los distintos mecanismos genéticos que producen el SA, resultan en la ausencia física o funcional de genes que se expresan sólo a partir del cromosoma 15 materno, y que no pueden ser complementados al encontrarse estos mismos genes silenciados en el cromosoma 15 paterno.
  1. Aproximadamente el 70% - 75% de los casos, se debe a una delección de un fragmento de ADN de 1 a 4 Mb de la región “q11-q13” en el cromosoma 15 procedente de la madre.
  2. Aproximadamente el 1% - 3% de los casos, presenta disomia unipaternal, es decir, dos cromosomas 15 de origen paterno y la falta del cromosoma 15 de origen materno. Este hecho sucede por error en el reparto de cromosomas durante la división celular, y puede ser debida a varios mecanismos: Aproximadamente el 3% - 6% de los casos, es consecuencia de la herencia de un cromosoma 15 paterno con impronta materna, es decir, existe un patrón de metilación alterado que podría corresponderse a la existencia de una mutación en el centro del ‘imprinting’ o centro de “marcaje”, que regula la desmetilación (activación de genes) de la región “q11-q13” en el cromosoma 15 de origen paterno, provocando que los genes sean inactivados (silenciamiento). Ejemplo clásico, un error en el Imprinting haría que una mujer transmitiera sus cromosomas con un Imprinting paterno.
    • Corrección de una trisomía 15: Un oocito femenino con dos cromosomas 15 fecundado por un espermatozoide normal que produce un zigoto con trisomía 15, corregida por una no-disyunción mitótica (mecanismo que indica una falla en el proceso de distribución equitativa de dos cromosomas o cromátides, ocaciona que ambos se dirijan juntos y el otro polo no reciba nada). Por lo tanto pueden pasar 3 eventos: si se produce la pérdida del cromosoma 15 de origen paterno, en un tercio de los casos, se manifestará la patología, mientras que en los otros dos tercios resultará un embrión normal.Este mecanismo fue confirmado por Purvis Smith y colaboradores en 1992.
    • Corrección de una monosomía 15: Un error de no-disyunción meiótica en la línea germinal masculina produciría un espermatozoide nulisómico (sin cromosoma 15), que fecundado por un oocito normal produce un zigoto monosómico con sólo el cromosoma 15 materno. Este zigoto es no viable, pero la duplicación mitótica del cromosoma 15 materno causaría la disomía uniparental materna, dando lugar al síndrome.
    • Complementación gamética: Se produciría por la no-disyunción simultánea del cromosoma 15 en ambos progenitores, con la fecundación de un oocito disómico por parte de un espermatozoide nulisómico, formándose un zigoto con dos cromosomas 15 maternos, dando lugar a la enfermedad. Es el mecanismo más infrecuente. Descrita por primera vez por Park y colaboradores en 1998.
  3. Aproximadamente el 20% - 25% de los casos, presentaron mutaciones intragénicas en el gen de la ubiquitina ligasa, UBE3A. Estas mutaciones son cambios en la secuencia de un gen individual que impiden producir una proteína funcional. Este gen UBE3A, está metilado en el cerebro pero no en otras partes del organismo. Esto supone que una mutación dentro de este gen en el cromosoma materno llevaría a la falta de expresión en el cerebro, puesto que aquí el gen paterno está imprintado (inactivado).
  4. Además de las alteraciones genéticas anteriormente citadas, se han descripto casos aislados de translocaciones balanceadas maternas y monosomías regulares 15q11-13. Independientemente del mecanismo genético, nos encontramos ante una entidad en la que el fenotipo clínico dependería de la falta o de la ‘inactivación’ del material genético de la región 15q11-q13 de origen materno.
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Figura 6 - Alteraciones del cromosoma 15 que pueden causar SA.

Cromosoma_15_SA.png
Figura 7 - Esquema representativo de una de las cromátides del cromosoma 15.
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Figura 8 - Esquema de la región 15q11-q13. Genes de expresión bialélica, en bordo; genes de expresión materna, en azul; genes de expresión paterna, en morado. Las flechas indican la orientación de la trascripción. CI: centro regulador de la impronta.

Todos los niños cuyos SA es sospechoso deberían tener un estudio genético, si el diagnostico se confirma, es recomendable que la familia reciba consejo de un genetista.

Historia

El pediátra Dr. Harry Angelman y colaboradores en 1965, fue el primero en describir la enfermedad en tres niños, como enfermedad neurológica con retraso mental profundo,convulsiones, ausencia de habla, risa inapropiada y ataxia. En 1987 (Magenis y colaboradores) fue cuando se tuvieron las primeras evidencias citogenéticas que asociaron el SA con la deleción intersticial 15q11-q13 en el cromosoma 15 materno. Luego en 1994 fue mapeado el gen UBE3A en la región crítica del SA.
Evidencias Clínicas
Muñecos felices (happy puppets) fue el apodo que adoptó el médico inglés Harry Angelman, al describir a tres pacientes que compartían dos características: un andar rígido y una risa excesiva. Sucede que, de la variedad de sentimientos que experimentan quienes padecen el síndrome que luego tomaría el apellido de Angelman, la risa es el más frecuente.
La mayoría de las reacciones de estos pacientes ante diferentes estímulos se ve acompañada de una risa parecida a una mueca facial; las conductas y los gestos de alegría son comunes, incluso algunos niños pueden presentar estallidos de risa.
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Paciente experimentando risa parecida a una mueca facial. Además se puede observar la separación dental y la boca grande.
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Ejemplo visual de microcefacial en pacientes con SA.

Síntomas característicos
Según un informe destinado a los familiares de estos pacientes y redactado por la Fundación Nacional del Síndrome de Angelman de los Estados Unidos, esta enfermedad se manifiesta principalmente a través de los siguientes síntomas:
  • Convulsiones
Son reportadas en más del 90 por ciento de los casos (ésta puede ser una sobreestimación ya que generalmente se informan los casos más severos). Un porcentaje de los niños con síndrome de Angelman presentan formas bastante particulares de epilepsia. Estas epilepsias se caracterizan por convulsiones sutiles, pero suficientes como para lograr la desconexión del niño con su medio.
  • Ausencia del lenguaje
Si bien algunos de estos niños parecen tener bastante comprensión como para desarrollar el lenguaje, incluso en los de menor retardo, éste no llega a desarrollarse. Una sola palabra como "mamá" puede tardar alrededor de 10 a 18 meses en pronunciarse, para luego ser usada en forma infrecuente, indiscriminada y carente de significado simbólico. A los 3 años los niños con mejor nivel de aprendizaje pueden comenzar a aprender cierto lenguaje no verbal: algunos apuntan a partes del cuerpo e indican algunas de sus necesidades a través de gestos simples.
  • Problemas motores
Durante los primeros años de vida han sido reportados movimientos hiperquinéticos del tronco y de las extremidades, y movimientos nerviosos o temblores que pueden estar presentes en los primeros 6 meses. Los movimientos voluntarios son a veces irregulares, variando de sacudidas ligeras a movimientos toscos no coordinados que se producen caminando, comiendo y alcanzando objetos. Los niños más severamente afectados pueden estar muy rígidos y sumamente inseguros, y accidentarse al caminar.
  • Retraso mental
Si bien el retraso mental es bastante común, a diferencia de otros cuadros de retardo mental severo, los jóvenes adultos con síndrome de Angelman suelen adaptarse socialmente y responden a la mayoría de las señales personales e interacciones. Manifiestan un interés por las personas, pueden establecer amistad y comunicar un amplio repertorio de sentimientos, enriqueciendo su relación con familiares y amigos. Pueden participar en actividades de grupo, quehaceres hogareños y responsabilidades cotidianas.
  • Hiperactividad
Es bastante frecuente, y se describe como hipermotricidad con un bajo tiempo de atención. Tanto los niños como los mayores pueden tener una actividad aparentemente incesante, guardando constantemente las manos o los juguetes en la boca, moviéndose de un sitio a otro, aleteo o golpeteo con las manos, etc. Conductas como agarrar, pellizcar o morder a otros niños pueden acentuarse por la actividad hipermotórica.
Epidemiología
En el SA la prevalencia se estima entre 1/10.000-1/20.000, siendo muchos casos esporádicos, aunque la ocurrencia familiar no es rara.

DiagnósticoEn 1995 Williams CA, Angelman H. y colaboradores propusieron las caracteristicas clínicas clasificadas como consistenctes o invariables, las más frecuentes y las asociadas al SA según el siguiente cuadro.
Diagnostico_clinico_de_SA.png


Las últimas recomendaciones para un correcto diagnóstico genético del síndrome de Angelman consisten en establecer:

  • Un cariotipo para reconocer las reorganizaciones cromosómicas de cromosomas metafásicos (empleando el antimitotico colcemid) con banda G para detectar posibles alteraciones de los mismos.Este análisis citogenético de alta resolución permite observar en pacientes SA, la presencia de una deleción aparentemente similar a la observada en los pacientes SPW pero localizada en el cromosoma 15 de origen materno. Esta coincidencia, en síndromes completamente diferentes, sugería no obstante que la deleción no podía ser idéntica, por lo que se comparó el tamaño de la deleción y las bandas implicadas. Además de las deleciones, se pudieron observar otras anomalías en el cromosoma 15 menos frecuentes como translocaciones, duplicaciones, cromosomas marcadores.
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    Cariotipos Normales. Imagen Izquierda: Prediseñada y coloreada. Imagen derecha: Real, bajo microscopía electrónica.

  • Realizar de forma sistemática, a todos los recién nacidos que presenten hipotonía severa, el test de metilación como prueba inicial del cribado. Existen 2 pruebas: Si se obtiene un resultado de test de metilación positivo, debe realizarse una prueba de FISH (técnica de hibridación in situ), para ver si el fallo se debe a una delección. Para valorar la presencia o ausencia de delección en 15q11-q13 se han utilizado sondas comercializadas D15S10 y GABRB3 dentro de la región crítica del SA.
    • Test de metilación mediante Southern blot: la región 15q11-q13 previamente digerida con las enzimas de restricción Hind III y Hpa II (sensibles al estado de metilacion, es decir, no cortan en el sitio especifico si el mismo se encuentra metilado) y posterior hibridacion con la sonda PW71B.
      Metilacion_Southern_Blot.png
      Línea 1: ADN control. Línea 2: paciente con Síndrome de Angelman. Líneas 3: Individuo normal. Línea 4: paciente con Síndrome de Prader-Willi. Las bandas de 6 y 4 Kb corresponden a los patrones normales de hibridación obtenidos en un individuo control que no tiene metilada la región15q13. Cuando existe metilación de la región donde se localiza el gen responsable del S.Prader Willi o del S.de Angelman, la enzima HpaII que es sensible al estado de metilación, no digiere el ADN observándose únicamente una sola banda de 4Kb (línea 2) o de 6Kb (línea 6), según sea el diagnóstico de Angelman o de Prader Willi
    • Test de metilación mediante PCR: la región 15q11-q13, previamente se desnaturalizó en una disolución de hidróxido de sodio, e incubado a 55ºC durante 16 horas en oscuridad con hidroquinona y bisulfito sódico. Posteriormente a este tratamiento, el ADN modificado se purificó y se realizo la Reaccion en Cadena de la Polimerasa utilizando cebadores y condiciones de reacción estrictamente controladas. Los productos de PCR fueron analizados en geles de agarosa Metaphor (FMC) al 3%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados con luz ultravioleta.
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      Línea 1: ADN control. Líneas 2: paciente con síndrome de Angelman. Línea 3: individuo normal. Línea 4: paciente con síndrome de Prader-Willi. El ADN que fue tratado con bisulfito siguiendo el protocolo de secuenciación genómica, se consiguió convertir las citosinas en uracilos, excepto aquéllas que se encuentran metiladas las cuales permanecerán inalteradas. De este modo, variará la secuencia nucleotídica, pudiéndose diferenciar el ADN que se encuentra metilado del que no lo está. Esta diferencia en la secuencia permite realizar amplificaciones específicas para cada alelo. Los individuos normales presentan las 2 bandas amplificadas (materna y paterna), los pacientes con SPW solo muestran la banda materna (174pb), y los pacientes con SA sólo la paterna (100pb).



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Localización de las sondas en el cromosoma 15: La sonda GABRB3 es de marcaje indirecto con digoxigenina y presentan una sonda control en la región distal 15q22 (PML). La sonda D15S10 es de marcaje directo. Incluyen dos sondas control, una centromérica para 15p11.2 (D15Z1) y otra distal para 15q22 (PML), que permite observar si ha habido alguna reorganización, como una translocación, que afecte a estas regiones.


Tras realizar la hibridación se observan al microscopio de fluorescencia las preparaciones y se cuentan unas 50 metafases para determinar si está o no presente la deleción. La forma de interpretar las señales observadas al microscopio es la siguiente:
Sondas_Sa.png

FISH.png
Imagen real de microscopía de fluorescencia. La fecha indica la deleción 15q11-q13 observada con la sonda SNRPN.



  • Si en el test anterior no se detecta la presencia de una delección, entonces se debe realizar un análisis de microsatélites que permita diferenciar si ambos cromosomas provienen del mismo origen parental (disomía uniparental materna), o si su origen es biparental (fallo del imprinting). Se han empleado siete microsatélites de la región 15q11-q13 correspondientes a los loci D15S210, D15S122, D15S113, GABRB3 y D15S97, de centrómero a telómero. Estos marcadores son repeticiones de CA y GT. Han sido escogidos por su informatividad y posición dentro de la región crítica de SA.

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Interpretación de los microsatélites

Luego de obtener los resultados de cada tecnica experimentada se observa el algoritmo diagnóstico deductivo de esta patología:

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Tratamiento

La enfermedad solo tiene tratamiento mediante la terapia genética, lo que no es garantía de éxito. Si ello no es posible, se intenta controlar y atenuar algunos de sus síntomas. La epilepsia, por ejemplo, se combate con medicación anticonvulsionante. La medicación a base de sustancias que incrementen el sueño está especialmente indicada, ya que los afectados suelen dormir un máximo de cinco horas. También son recomendables terapias de tipo ocupacional, terapias del habla, hidroterapia o incluso musicoterapia.


L‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍as alteraciones en el "imprinting" de la región "p14-p15.5" del cromosoma 11 da lugar al Síndrome de Beckwith-Wiedemann que se describen a continuacion.
Síndrome de Beckwith Wiedemann (SBW)

Definición
Es un conjunto de signos y síntomas asociados a una alteración genética que se debe a la desrregulacion del imprinting en una región
crítica en el brazo corto del cromosoma 11. Tal enfermedad se caracteriza por un sobrecrecimiento congénito, clínica y genéticamente heterogéneo.

Aspectos Genéticos del Síndrome de Prader-WilliEs un desorden complejo, multigénico, causado por la disrregulación del imprinting de los genes reguladores del crecimiento en el cromosoma 11p15.5 Tres genes han sido implicados en la patogénesis del SBW: IGF2, H19 y p57kip2, aunque la mayoría de los casos son esporádicos y presentan un cariotipo normal.
No existe un patrón de herencia fijo, aunque en algunos casos se puede identificar un patrón de herencia autosómica dominante.

Historia
Fue descrito por primera vez en 1963 por Beckwith en autopsias de infantes con la asociación de macroglosia, hiperplasia renal, pancreática y adrenal, onfalocele y macrosomía. Posteriormente, en 1964 Wiedemann reportó tres casos con lesiones similares, aunado a defectos del diafragma (hernia umbilical) e hipoglicemia sintomática secundaria a hiperplasia de las células beta pancreáticas.
Evidencias Clínicas
clínicamente los signos y sintomas caracteristicos son macrosomía, macroglosia, onfalocele o hernia umbilical e hipoglicemia hiperinsulinémica desde el nacimiento, y quienes lo padecen tienen mayor probabilidad de presentar tumores embrionarios en la infancia, fundamentalmente en hígado o riñón.La incidencia de hipoglicemia hiperinsulinémica en niños con SBW esté cerca del 50%. En la mayoria de los casos esta hipoglucemia es transitoria, pudiendo ser asintomática y resolverse en los primeros días de vida. En cerca del 5% de los casos es permanente y se extiende al período neonatal tardío, requiriendo alimentación continua, terapia médica y en casos raros, pancreatectomía parcial. Los niños con SBW presentan mayor riesgo de desarrollar tumores de estirpe embrionaria, cerca del 75% de los casos, independientemente de la expresión forma total o parcial de la patología.

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Nevus flammeus y macroglosia

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TAC (4x). Obsérvese el gran tamaño de ambos riñones, (señalado con flechas), evidenciado en sus diámetros anteroposterior.

Epidemiologia
La frecuencia del SBW es de 1 por 13.700 nacimientos y puede dividirse en formas completas e incompletas.

Diagnóstico

La presencia de los hallazgos clínicos no debe ofrecer dificultades para su diagnóstico postnatal; sin embargo, éste síndrome es un ejemplo de patología diagnosticable in útero.
Las alteraciones genéticas mas frecuentemente descritas en este síndrome incluyen la determinación por PCR del loci polimorfo 11p15.5, para detectar delecciones maternas o inversiones, duplicaciones paternas o disomia uniparental; aunque hasta el presente no existen criterios fijos para el diagnóstico prenatal en base a estos criterios.